21. Обзор достигнутого и перспективы

Итак, мы постарались взглянуть на проблему живых часов с разных точек зрения: исторической — от самого первого наблюдения над живыми часами в 1729 году до сегодняшнего дня; генетической — от простого одноклеточного организма до такого сложного и высокоорганизованного, как человек; географической — от Скандинавского полуострова до Южного полюса и от берегов Атлантического океана до Тихого. Перед нами предстало множество согласующихся и противоречащих друг другу теорий и идей, мы встретились с самыми разными учеными.

Попробуем подвести некоторый итог, с тем чтобы выявить основные взаимосвязи и представить себе перспективу развития новой области знаний. Сделаем это с помощью Колина Питтендрая, профессора биологии Стэнфордского университета.

Когда Питтендрай занимался исследованием природных условий существования очагов малярии, его внимание привлекла цикличность в поведении комаров и возбудителей малярии, а затем и проблема биологических часов в целом.

Но поскольку комар неудобен для лабораторных исследований, Питтендрай остановил свой выбор на дрозофиле. В качестве «стрелок биологических часов» он избрал время выхода взрослых особей из куколок. Результаты своих многочисленных экспериментов Питтендрай опубликовал в 1954 году; его статья произвела очень большое впечатление на биологов. Б. Суини и Дж. Гастингс так охарактеризовали его работу:

В начале пятидесятых годов стало ясно, что постоянство периода биологических ритмов при различных температурах имеет огромное значение… Но более убедительно гипотеза о биологических часах, определяющих устойчивые суточные ритмы, была сформулирована в изящной работе Питтен-драя на дрозофиле. В его статье проблема температурной независимости была впервые рассмотрена достаточно полно и заняла то место, которое мы отводим ей сейчас. После этого быстро распространился взгляд, что ритмы отражают деятельность механизма измерения времени, для которой независимость от температуры имеет принципиальное значение.

Мы не можем сказать, что эти вопросы ранее не рассматривались и не были оценены по достоинству. Конечно, их важность была понятна. Но усилия исследователей были направлены в другую сторону.

В 1965 году на симпозиуме, который проходил в Клаудкрофте (штат Нью-Мексико) и отличался от предыдущих тем, что охватывал широкий круг вопросов, Питтендрай сделал доклад о биологических часах. Последовавшая за ним дискуссия продолжалась почти четыре часа. Поскольку этот доклад насыщен большим количеством специальной терминологии, мало понятной широкому читателю, мы дадим его сокращенное изложение.

Биологические часы. Прошлые и современные представления о функционировании циркадных ритмов

Феномен де Мэрана

Бюннинг обратил внимание на короткую запись одного наблюдения, сделанного в 1729 году французским астрономом де Мэраном, заинтересовавшимся суточными движениями листьев некоторых растений. Полагая, что объяснение этому явлению каким-то образом связано с окружающими условиями, он перенес чувствительное растение в темное помещение, куда не проникали суточные изменения освещенности и температуры. К своему удивлению, де Мэран обнаружил, что и в этих условиях, казалось бы совершенно лишенных каких-либо периодических изменений, суточная периодичность движения листьев устойчиво сохранялась. Понимая важность этого открытия, де Мэран рассказал о нем ботаникам, но при этом выразил сомнение в скором развитии исследований в этой области, так как не представлял себе экспериментальных подходов к изучению столь удивительного открытия.

Феномен де Мэрана привлекал внимание многих выдающихся ботаников XIX столетия, среди которых были Декандоль, Гофмейстер, Дарвин, Сакс, Пфеффер. В 1875 и 1915 годах вышли две книги Пфеффера об устойчивой ритмичности суточных движений листьев.

Саксу уже в конце XIX столетия было ясно, что световой цикл окружающей среды, никак не влияя на ритмы у растений, служит лишь контролем временной периодичности, которая обусловлена, по-видимому, другими причинами. В это время очень многие ботаники интересовались приспособительными функциями подобных ритмов. Дарвин был даже уверен, что возникновение у растений в результате естественного отбора способности измерять время неизбежно приводило к появлению адаптивных преимуществ.

Эндогенное (или экзогенное) происхождение ритмов

Зависимость биологических ритмов от окружающих условий была основным предметом обсуждения в научной литературе на рубеже XX столетия вплоть до 1930 года. Предполагалось, что сохранение ритмов в условиях постоянной темноты и постоянной температуры зависит от действия на организм неких внешних сил. Называли, например, неизвестный фактор X, который якобы представляет собой еще не выявленную периодичность в окружающей среде. Даже в наше время имеется лаборатория, которая признает существование такого фактора. Профессор Браун из Северо-западного университета опубликовал большую серию статей, в которых сообщает об обнаружении точной 24-часовой ритмической активности живых организмов (дыхание, движение и т. д.), фазы которой тесно связаны с местным временем. Эту периодичность (реальность существования которой пока еще не обоснована) Браун приписывает влиянию фактора X. Однако позиция его подвергается серьезной критике со стороны большинства работающих в этой области ученых, уже давно пришедших к заключению, что феномен де Мэрана полностью зависит от эндогенных (внутренних), а не от экзогенных (внешних) причин.

Доказательство такой точки зрения опирается на результаты многочисленных наблюдений. Вот основные. Периодичность, сохраняющаяся в постоянной темноте и при постоянной температуре, может быть нарушена прекращением доступа необходимого организму кислорода, то есть переводом его тканей в состояние аноксии, а также охлаждением организма до температуры, при которой приостанавливается его обмен. Когда же подача кислорода возобновляется или температура повышается до уровня, необходимого для нормального течения обмена, ритмическая активность восстанавливается. Энергия, необходимая для поддержания этих колебаний, вырабатывается в процессе обмена веществ. Ритм возобновляется с того самого момента, когда он был остановлен. Этот факт очень важен, поскольку он свидетельствует о независимости фазы ритма в постоянной темноте от местного времени, то есть от вращения Земли. Значит она должна быть независимой от всех факторов, связанных с вращением Земли (включая и фактор X).

Наибольшее впечатление производит тот факт, что период ритмической активности, сохраняющийся в темноте, отличается от периода вращения Земли. Сторонники эндогенной природы ритмов считают, что, только допустив очень громоздкие и маловероятные предположения, можно объяснить, например, происхождение периода длительностью в 23 часа 15 минут влиянием неизвестного внешнего фактора с периодом точно 24 часа.

Для колебаний, открытых де Мэраном, Халберг ввел термин «циркадный» (околосуточный). Этот термин подчеркивает различие в длительности периода колебаний и периода вращения Земли. Кроме того, он исключает двусмысленность, имеющуюся в термине «дневной» (в одних случаях им обозначают дневное время суток, в других — используют его в значении «суточный»). Период циркадного ритма лишь приблизительно равен периоду вращения Земли вокруг своей оси.

Организмы, принадлежащие к одному и тому же виду, генетически различаются между собой по длительности периодов свободнотекущих ритмов — периодов, которые они обнаруживают в условиях, исключающих влияние изменений светового цикла окружающей среды.

Было бы несправедливо объединять профессора Брауна с ранними исследователями фактора X, поскольку он не считает, что этим фактором можно полностью объяснить феномен де Мэрана. Браун не отрицает возможность существования периодичности и внутреннего происхождения. Его интерес к фактору X определяется потенциальной ролью последнего, как своего рода регулятора ритма, который обеспечивает точность внутренним колебаниям и компенсирует изменения температуры.

Всеобщность и распространенность циркадных ритмов

Феномен де Мэрана наблюдали у очень большого числа самых разных организмов: одиночных клеток, растений и животных, включая человека. Этот феномен является общей характеристикой физиологической организации живых существ на нашей планете. У одноклеточной светящейся водоросли Gonyaulax Гастингс и Суини обнаружили циркадные колебания фотосинтеза и клеточного деления. У мышей и крыс наблюдаются ритмические изменения фактически всех изучавшихся параметров: химического состава крови, деления клеток, температуры тела, чувствительности к рентгеновским лучам и наркотикам и т. д.

Практическое значение недавних открытий в этой области очень велико. Определенная доза токсического вещества, выделенного из кишечной палочки человека, убивает 85 % мышей при введении его в одной фазе их циркадного цикла и только 5 % — в другой. Аналогичный эффект был обнаружен Халбергом для действия сердечного стимулятора строфантина. Фаза циркадного цикла организма — очень важный параметр, которым физиолог не может и не должен пренебрегать. Тем более фармаколог!

Как сообщает Питтеидрай, поведение дрозофил и их устойчивость к изменению температуры различны на разных фазах циркадного ритма. Кроме того, выявлены заметные изменения в удельной активности ферментов при испытании любой ферментной системы in vitro (в искусственных условиях), если она изъята из организма не днем, как обычно, а глубокой ночью. Наблюдаются различия в скорости реакции между ферментом и субстратом (веществом, с которым он реагирует).

Точность, врожденных и температурная независимость циркадных ритмов

Циркадные ритмы удобнее всего изучать, регистрируя ту или иную особенность поведения организма в целом. Так, при работе с млекопитающими очень удобно наблюдать за их двигательной активностью. Грызуны, например, любят бегать во вращающихся клетках. Время начала активности и ее продолжительность легко регистрируются, если соединить вращающуюся клетку с микровыключателем и самописцем. Как только клетка начинает вращаться, перо самописца вычерчивает линию, длина которой пропорциональна времени активности (рис. 54). Начало активности при 24-часовом цикле чередования света и темноты соблюдается точно. Ночные животные начинают свою активность где-то около «заката». Если такой организм поместить в условия постоянной темноты и постоянной температуры, период активности сохраняется с удивительным постоянством и неограниченно долго. Интервал, отделяющий начало одной активности от другой, и есть период циркадного ритма.

Наиболее поразительная особенность циркадных ритмов — это сохранение их точности и постоянства в течение неограниченно долгого времени. Стандартная ошибка в длительности периода для свободнотекущих ритмов некоторых грызунов может составлять не более одной минуты. Другими словами «ошибка» составляет величину порядка 0,001.

Более того, эта ритмичность является врожденной. Она не заучивается на основании индивидуального опыта. Врожденность ритмов была показана на одноклеточных организмах, на насекомых и позвоночных.

Возможно, наиболее удивительным свойством циркадных ритмов является тот факт, что на их периоде почти совсем не сказываются даже значительные изменения температуры. Эта температурная независимость ритмов по праву представляет собой отдельную большую проблему. Трудность простого физиологического объяснения этого явления определила, по крайней мере отчасти, возобновление интереса Брауна к возможному существованию и влиянию на организмы внешнего регулятора ритмики (фактора X).

Рис. 54. Циркадные ритмы двигательной активности оленьей мыши. Цикл чередования света и темноты (СТ 1: 23) выдерживался 59 дней. К шестому дню ритм был затянут этим циклом. Начиная с 60 по 92 день вводятся условия постоянной темноты и ритм опять становится свободнотекущим. С 93 по 132 день мышь выдерживают в условиях СТ 18: 6, затем опять в условиях постоянной темноты. Обратите внимание на удивительную точность периода свободнотекущего ритма.

Клеточная основа циркадных ритмов.

За последние десять лет был установлен очень важный факт — циркадные ритмы существуют на всех уровнях организации. По данным Соннборн и Барнетт, представители Paramecium multimicronucleatum могут с правильной периодичностью переходить от одного типа размножения к другому в течение суток.

Некоторые ученые пытались найти ритмы на уровнях организации ниже клеточной. В частности, пытались выяснить, является ли ядро клетки или другая ее часть (например, цитоплазма) тем местом, где возникает ведущий ритм.

Суини и Хэксо, а также Рихтер выполнили несколько замечательных работ с водорослью Acetabularia, которая представляет собой очень удачный объект для подобных экспериментов. Дело в том, что у этого одноклеточного организма можно удалить отдельные части, и он не погибает. Исследователи, удалив при помощи очень тонкой хирургической операции ядро клетки, пытались выяснить, способна ли одна протоплазма поддерживать циркадный ритм — в данном случае ритм фотосинтеза. Оказывается, способна, и даже в течение целых тридцати циклов.

Швейгер с сотрудниками, пересадив ядро из одной клетки в другую, изготовили «синтетическую клетку», у которой ритм ядра и цитоплазмы расходились по фазе на 12 часов. При этом они обнаружили, что ритм клетки определяется ядром.

Попытки изменить циркадные ритмы действием химических веществ, как правило, оказывались безуспешными. Исследователи считают, что клеточные ритмы не чувствительны к действию химических веществ. Однако результаты их экспериментов нельзя считать достоверными, поскольку использованные вещества не имели в своем составе радиоактивных элементов и, следовательно, не было уверенности, что они проникали в клетки в необходимых для этого количествах.

Результаты некоторых экспериментов были явно положительными, но не все их можно признать вполне убедительными. Гастингсу удалось, по-видимому, сдвинуть ритм Gonyaulax воздействием цианида мышьяка и р-хлормеркурибензоата. Бюннинг опубликовал данные об изменении длительности периодов под действием колхицина, уретана и этилового спирта. Брюс и Питтендрай обнаружили, что тяжелая вода влияет на фазу и длительность периода деления клеток Euglena. Но ни один из этих результатов не позволил авторам сделать какие-либо предположения относительно химической основы циркадных ритмов.

Рис. 55. Суточные движения листьев фасоли при постоянном слабом свете под влиянием этилового спирта. На графике пунктирная линия соответствует нормальному ритмическому поведению контрольного растения фасоли, а более вялая и неустойчивая сплошная линия — поведению подопытного растения. Результат этого эксперимента свидетельствует о существовании циркадного ритма, который заметно нарушается под действием спирта.

Одними из наиболее интересных исследований в этом направлении являются эксперименты Каракашьяна и Гастингса. Известно, что антибиотики действуют на образование информационной РНК, то есть на первый этап считывания наследственной информации. Экспериментаторы обнаружили, что после обработки клеток Gonyaulax актиномицином-Д ритмы люминесценции и фотосинтеза затухают. Этот результат представляет несомненный интерес, но значение его пока не вполне ясно. Сама по себе утрата ритмов никоим образом не свидетельствует о том, что данное вещество действует на часы клетки. Поражаемым участком вполне может оказаться система сопряжения часов (или ведущего колебания) с исследуемой физиологической системой.

Показателем изменения работы часов может быть либо изменение длительности фаз, либо изменение устойчивости ритма. Совсем недавно Штрумвассеру удалось ввести различные химические вещества в одиночные клетки ганглия у моллюска Aplysia. Изучение ритма позволило обнаружить четкий сдвиг его фазы при попадании в клетку актиномицина. Но ритм клеток ганглия удается измерять пока только в течение одного цикла после воздействия. Поэтому неизвестно, сохранится сдвиг фазы (значит, затронут ведущий ритм) или нет (значит, нарушено какое-то звено сопряжения между ведущим ритмом и изучаемым).

Эксперименты, выполненные Эретом и независимо от него Суини, показали, что ультрафиолетовое излучение ртутной лампы может изменять фазу ритма. Это позволяет предположить, что циркадный ритм клетки непосредственно связан с системой нуклеиновых кислот (ДНК — РНК). Для полного обращения фазы ритма оказалось достаточно всего нескольких минут облучения. Эти результаты свидетельствуют о том, что механизм действия ультрафиолетового излучения и видимого света различен.

Клетка и организм как осцилляторы, управляемые световыми циклами

Еще в 1957 году Брюс и Питтендрай отмечали, что формально циркадные ритмы представляют собой самоподдерживающиеся колебания. Для доказательства этого положения они сравнивали систему «организм и окружающая его среда» с двумя колебательными системами, одна из которых затягивает другую. Циркадные колебания в клетке и организме четко отражают колебания в их естественном окружении, а это предполагает взаимосвязь биоритмов с внешним циклом природных изменений. «Надлежащая» связь между системами достигается главным образом за счет светового цикла. Биоритмы сопряжены со световым циклом и затягиваются им или целиком подчиняются ему. Но ритм не наводится световым циклом^[22]. Действие светового цикла сравнимо с действием одной колебательной системы на другую, независимую, самоподдерживающуюся колебательную систему.

Период (или частота) затягиваемого колебания точно следует периоду (или частоте) затягивающего цикла. Те или иные конкретные явления в организме наблюдаются в определенное время затягивающего цикла.

Рис. 56. Слева — дрозофил культивируют в условиях нормального чередования света и темноты: взрослые особи появляются перед рассветом. В центре — культура содержится в условиях постоянной темноты: мушки теряют чувство времени и выходят из куколок в неопределенное время. Справа — короткая вспышка света, данная в ранний период развития, переводит часы дрозофил: зрелые особи появляются из куколок во время, соответствующее времени вспышки.

Мы не будем детально излагать все, что известно в настоящее время о механизме затягивания светом. Достаточно отметить лишь несколько положений, представляющих общий интерес.

Во-первых, световые циклы оказывают универсальное действие в затягивании циркадных ритмов. Для холоднокровных животных таким затягивающим действием могут обладать и температурные циклы, но они, по-видимому, менее действенны. Это подтвердила недавняя работа Циммермана, выполненная им на дрозофилах.

Во-вторых, наблюдения Халберга, Рихтера, а также результаты Питтендрая показали, что у млекопитающих такие затягивающие сигналы света преобразуются через органы зрения^[23]. Ослепленные мыши, крысы и хомяки не воспринимали затягивающего действия световых циклов. Но весьма вероятно, что этот путь носит вторичный характер. Если гипоталамус (часть переднего мозга, контролирующая различные центры, которые в свою очередь регулируют деятельность внутренних органов, водный баланс в организме, температуру тела, сон и т. д.) действует как управляющий центр системы циркадных ритмов, то для связи его со световым циклом окружающей среды необходима промежуточная связь с каким-либо поверхностным фоторецептором. Следует, однако, отметить, что данные Ганонга о проникновении видимого света в мозговой ствол позвоночных заметно снижают силу этого аргумента. К тому же экспериментально показано, что циркадная система дрозофилы может воспринимать влияние затягивающего цикла и тогда, когда мушка находится в стадии личинки и не имеет организованного фоторецептора.

Несколько исследователей (среди них Лис и Уильяме) показали, что фотопериодическое воздействие света (которое, как мы видели, является функцией циркадного ритма) может осуществляться в результате непосредственного поглощения света тканью центральной нервной системы. Для одноклеточных организмов и зеленых растений вопрос об организованном «глазе» не возникает. И тем не менее все они также подвержены затягивающему действию светового цикла. По-видимому, какая-то молекула в клетке, не специализированная для восприятия света в общепринятом смысле, поглощает свет и осуществляет непосредственную связь с ведущим механизмом циркадного цикла.

Хронометрия на основе циклов. Ориентация по небесным телам и фотопериодизм

Брюс и Питтендрай считают, что возобновление интереса к циркадным ритмам, наблюдавшееся с 1950 года, вызвано главным образом классическими экспериментами Крамера и Фриша, которые открыли, что птицы и пчелы, пользуясь солнцем как компасом, могут придерживаться заданного направления в любое время дня. Перемещение солнца по небу животные компенсируют с помощью внутренних часов. Гоффман и другие исследователи показали, что часы животных работают по местному времени, в полном соответствии со световым циклом окружающей среды. Кроме того, Гоффман обнаружил, что часы скворцов продолжают действовать и при постоянном слабом освещении. Свободнотекущий период их циркадного ритма составляет около 23,5 часа.

Бюннинг почти за пятнадцать лет до исследований Крамера и Фриша связал циркадные ритмы с совершенно иным явлением — с фотопериодизмом. В 1920 году Гарнер и Аллард показали, что переход растений от вегетативного роста к цветению зависит от количества светлых часов в каждом суточном цикле, то есть от фотопериода. В 1936 году Бюннинг пришел к выводу, что эндогенная «суточная» ритмичность растений связана с фотопериодом. По его мнению, то, что мы теперь называем циркадным ритмом растения, состоит из двух полуциклов — светового (названного им «фотофильным») и темнового (или «скотофильного»).

Световой полуцикл эквивалентен дневной фазе циркадного ритма, а темновой — его ночной фазе. В зависимости от времени года растение на ранней фазе темнового периода будет либо освещенным, либо неосвещенным. Если ранняя фаза темнового периода попадает на светлое время суток, то растения короткого дня переходят к цветению, а растения длинного дня — не переходят. Значит, циркадный ритм служит растению часовым механизмом для скрытого измерения времени. В этом суть гипотезы Бюннинга, которая оказалась чрезвычайно полезной для понимания биологической ритмичности. Она предвосхитила современый взгляд на измерение времени как на узловую проблему фотопериодизма и на оценку циркадных ритмов как всеобщих биологических часов.

Древняя, или первичная, функция циркадных ритмов

Со времен Дарвина ботаники пытались определить адаптивную значимость циркадных ритмов. Но для многих циркадных ритмов не удается отыскать видимой адаптивной функции. Реммерт (1962) вполне оправданно подверг сомнению адаптивную пользу ритма размножения дрозофил. В адаптивной функции огромного числа ритмов, наблюдающихся при метаморфозе насекомых, разобраться действительно трудно.

Огромное разнообразие циркадных ритмов неизбежно ставит перед учеными вопрос об их происхождении. Несомненно, многие циркадные системы имеют независимое происхождение, а сходство некоторых из их внешних признаков является следствием конвергенции^[24]. При независимом происхождении циркадных систем одной конвергенцией трудно объяснить сходство между ритмами, особенно такие их свойства (наиболее «невероятные», с точки зрения физиологов), как точность и температурная независимость. К тому же ритмы сходны своей зависимостью от цикличности освещения. Короче говоря, жаль отказываться от рабочей гипотезы об общей древней основе циркадных ритмов, а также о том, что эволюционно они предназначены для выполнения некой функции. Немногие, известные сегодня функции ритмов являются вторичным проявлением этой организации, возникшей для выполнения других потребностей организма^[25].

Существует ли в действительности такая древняя первичная функция, конечно, неизвестно, и на этом обсуждение этого вопроса можно было бы кончить. Однако живой организм представляет собой продукт исторического развития, определяемого естественным отбором, цель которого сводится, в сущности, к выработке функциональной приспособленности. И поэтому признание возможного существования некоторой еще неизвестной функции может открыть для исследователей новые полезные подходы к решению этого вопроса.

Многое в предположениях Питтендрая, несомненно, окажется неверным. Однако его рассуждения оправданы уже потому, что, ставя вопрос о возможном существовании первичной функции циркадных ритмов, они побуждают ученых к постановке новых экспериментов.